NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM 1

Tài liệu được sưu tầm từ

“NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM”

Link tải bản PDF : https://drive.google.com/open?id=1mwsNrUgY21CbG8o8KxFBE2kXCOTb_v_f

TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là để sản xuất steviosid và rebaudiosid A có độ
tinh khiế
t cao, chiết xuất từ lá cây làm chất tạo ngọt cho thực phẩm và dược
phẩm
. Lá Cỏ Ngọt được sấy khô và nghiền nhỏ thành bột, bột lá Cỏ Ngọt
được chiết xuất bằng nước
, dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và
sau đó bằng sắt
(III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu và làm
bay hơi dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp
glycosid thô. Hỗn hợp glycosid
thô tiến hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử
dụng metanol
, etanol để kết tủa, thu được steviosid và rebaudiosid A có độ
tinh khiết c
ao. Tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình
chi
ết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và thời gian chiết xuất
tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự phân lập và tinh
sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng
metanol để kết tủa
. Tỷ lệ hỗn hợp glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7
w/v, tốt nhất là 1:5, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 91,1-91,5%.
S
phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng
etanol để kết tủa. Tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất
là 1:5.
Rebaudiosid A v
ới 90,790,9% độ tinh khiết thu được. Steviosid và
rebaudiosid A là hai ch
ất tạo ngọt không sinh năng lượng, không đắng, áp
dụng trong thực phẩm và dược phẩm.
Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập

ABSTRACT
The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and
rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in
food and drugs. Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered
leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified
using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron
chloride, desalting, decolorizing, and evaporating the filtrate to
drynessobtained glycoside. The mixture of glycosides, conducting isolation
and purification of stevioside and rebaudioside A were developed using
methanol, alcoholic precipitation.The highly purified stevioside and
rebaudioside A were obtained.The preferable ratio of leaves to water is
within the limits of about 1:20 to 1:25, wt/vol.The extraction temperature and
time preferably were at 75
oC for 240 min and and 100oC for 30min. The
isolation and purification of Stevioside was developed using methanol
precipitation.
The proportion of glycosides and methanol was between 1:2-
1:7 w/v, preferably 1:5, the powder contents were around 91.1-91.5% of
stevioside.
The isolation and purification of rebaudioside A was developed
using ethanol precipitation.
The proportion of syrup and ethanol was between
1:2-1:7 w/v, preferably 1:5. Rebaudioside A with 90.7- 90.9% purity was
obtained. Steviosid and rebaudiosid A are two sweeteners
non-calorie, noncariogenic, non-bitter, applied in foods and drugs.
Keywords: Stevia rebaudiana, extracts, stevioside, rebaudioside A,
purification, isolation.

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt ………………………………Error! Bookmark not defined.
Hình 2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy
trong lá của cây
Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan. …………….. 8
Hình 3.2.1 S
ơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá
trình chiết ……………………………………………………………………………………….. 17
Hình 3.2.2 S
ơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong
quá trình chiết …………………………………………………………………………………. 19
Hình 3.2.3 S
ơ đồ bố trí thí nghim phân lập, tinh sạch steviosid
rebaudiosid A………………………………………………………………………………….. 22
Hình 4.1 Kh
ảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu………………………….. 25
Hình 4.2 Kh
ảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích ………………. 26
Hình 4.3.1
Sắc ký đồ chuẩn steviosid ………………………………………………….. 28
Hình 4.3.2 S
ắc ký đồ mẫu steviosid…………………………………………………….. 29
Hình 4.3.3 S
ắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A…………………………………………… 33
Hình 4.3.4 S
ắc ký đồ mẫu rebaudiosid A……………………………………………… 31
Hình 1 Lá C
ỏ Ngọt…………………………………………………………………………… 50
Hình 2 C
ột Amberlite……………………………………………………………………….. 50
Hình 3
Dịch sau khi qua Amberlite …………………………………………………….. 51
Hình 4 B
ếp cách thủy……………………………………………………………………….. 51
Hình 5 H
ỗn hợp glucosid…………………………………………………………………… 52
Hình 6 Steviosid
……………………………………………………………..52

Hình 7 Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ………………………………………………53
Hình 8 Dung d
ịch Cỏ Ngọt…………………………………………………..53
Hình 9 Quy trình phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA………….54

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của
cây Cỏ Ngọtvà độ ngọt so với đường sucrose. ……………………………………….. 9
B
ảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid ……………………………….. 32
B
ảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A ………………………… 32

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

HPLC
µm
mg/L
mL
nm
% (v/v)
RT
UV
Vis
RPF
sắc ký lỏng hiệu năng cao
micromet
milligram trên lít
millilit
nanomet
ph
ần trăm thể tích trên thể tích
thời gian lưu
đầu d
ò tử ngoại khả kiến
lưu lượng huyết tương
qua thận
GFR
LC-MS
tăng tốc độ lọc cầu thận
sắc ký lỏng khối phổ

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay trên thế giới, con người tiêu thụ một lượng đường rất đáng kể.
Tuy nhiên ngoài mặt lợi đường cũng có những mặt trái của nó do cung cấp
nhiều năng lượng nên có thể gây béo phì
, cho dù liều lượng sử dụng không
đáng kể
. Vì vậy để tránh béo phì, tiểu đường thì người ta buộc phải dùng
đường ít lại hay dùng một chất tạo ngọt khác để thay thế
. Hiện nay, trên thị
trường đã có rất nhiều sản phẩm hoá học tạo vị ngọt dùng để thay thế đường
như saccharin, sodium cyclamate, sucrolose, acefulfame potassium nhưng phổ
biến nhất là chất aspartame
. Mặc dù các loại đường này rẻ tiền và tiện dụng
nhưng người ta rất e ngại khi sử dụng vì chúng có thể gây ảnh hưởng xấu đến
sức khoẻ con người về lâu về dà
i. Qua một số nghiên cứu cho thấy saccharin
gây ung thư bàng quang ở chuột. Vì vậy saccharin đã bị cấm sử dụng ở một
số quốc gia
. Trước các nguy hại của đường hoá học, tâm lý chung của người
tiêu dùng là muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật
. Cây
C
ỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) là loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam
Mỹ
, lá cây Cỏ Ngọt có chứa các chất ngọt tự nhiên như steviosid (4-13% trên
trọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1
2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E và dulcosid A (0,40,7%) (Kinghorn et al.,
1991).
Trong đó độ ngọt của rebaudiosid A gấp 250 450 lần so với đường
mía và steviosid khoảng
300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986). Chất
tạo ngọt chứa trong cây
Cỏ Ngọt là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng.
Ngoài ra, ch
ất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt còn điều trị được bệnh tiểu đường,
hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp
(Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm
(Ghosh
et al., 2008). Đặc biệt trong cây Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo ngọt
steviosid và rebaudiosid A với độ ngọt cao và chiếm hàm lượng lớn nhất
.Từ những lợi ích to lớn đó đã dẫn đến nhu cầu con người muốn sử dụng sản
phẩm chất tạo ngọt tự nhiên
, đặc biệt là hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A.
Do đó việc ly trích và tinh sạch để có hai loại chất tạo ngọt
steviosid và rebaudiosid A với độ sạch cao, an toàn cho thực phẩm và dược
phẩm là rất cần thiết
. Xuất phát từ thực tế này, “Nghiên cứu chiết xuất và
tinh sạch steviosid rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana)
làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm” được thực hiện nhằm
góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xây dng quy trình chiết xut, tinh sch 02 hp cht tự nhiên đặc trưng từ cây
C
Ngt là steviosid và rebaudiosid A làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và
dược phẩm
.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành 3 nội dung chính sau đây:
– Kh
ảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn
hợp glucosid thô.
– Kh
ảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glucosid
thô.
– Phân l
ập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt
Vào năm 1887, MS Bertoni, một nhà thực vật học là người châu Âu đầu tiên
nghiên c
ứu về Cỏ Ngọt. Sau đó vào năm 1931, nhà hóa học Pháp đã ly trích
được steviosid. Steviosid là hợp chất tinh thể màu trắng có độ ngọt rất cao.Từ
đó Cỏ Ngọt được sử dụng như một chất làm ngọt ở Anh trong thế chiến II.
Nhật Bản đã sử dụng Cỏ Ngọt để thay thế cho saccharin sau khi nó bị cấm s
dụng vào những năm của thập niên 70 và chất ngọt từ Cỏ Ngọt được tiêu th
tại Nhật Bản với số lượng rất lớn so với bất kỳ quốc gia nào khác. Tại Bắc
Mỹ và Châu Âu, Cỏ Ngọt bắt đầu được sử dụng như là sản phẩm thảo dược
và có sẵn trên thị trường vào những năm 1970 và 1980. Cỏ Ngọt đã được
chiết xuất và cho phép sdụng ở Mỹ vào năm 1994.
2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt
2.2.1 Thực vật học (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Tên khoa h
ọc: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt

Họ: Cúc (Asteraceae).
Cây th
ảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 – 0,6 m và có khi cao tới 1m. Thân
c
ứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.Lá mọc đối,
hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài 5 -7 cm, rộng 1 –
1 , 5 cm, có 3 gân, 4-
6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có
lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn. Hoa
lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn. Quả bế, không có mào lông,
h
ạt không có nội nhũ. Mùa hoa khoảng tháng 5-9
2.2.2 Phân bố, sinh thái (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Chi Stevia Cav không có một đại diện nào ở vùng châu Á. Cỏ Ngọt đang
được trồng phố biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam
Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988. Cỏ Ngọt là cây ưa ấm và ưa sáng, có
thchịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kỳ cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới,
Cỏ Ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân – hè. V
mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi tàn lụi.
Cây ra hoa, quả nhiều
hàng năm. Tuy nhiên, người ta thường áp dụng c
ách nhân giống bằng cắm
cành.
2.2.3 Bộ phận dùng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Phần trên mặt đất của cây Cỏ Ngọt. Thu hái lúc cây xum xuê.
2.2.4 Tác dụng dược lý (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
2.2.4.1 Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ Ngọt
có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và bệnh
nhân mắc bệnh đái tháo đường.
2.2.4.2 Tác dụng giãn mạch: steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh mạch toàn
thân rõ r
ệt.

2.2.4.3 Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá cây C
Ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng tốc độ
lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri.
2.2.4.4 Tác dụng kháng khuẩn
Cao lá Cỏ Ngọt có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và Proteus
vulgaris.
Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khun
Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei
nh
ững vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay có
dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo.
2.2.4.5 Liều dùng an toàn ở người
Nồng độ steviosid trong một số nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 – 0,007%.
N
ếu một ngày uống 1 lít thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 – 0,07g
tương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều
an toàn, đ
ã được Nhà nước Nhật cho phép.
2.2.4.6 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không thấy có
chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi.
2.2.4.7 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng hàng ngày
0,5g/kg trong 56 ngày, các thông s
ố theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết
học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tchức học gan đều bình thường.
2.2.4.8 Độc tính trên thận:
Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc với thận,
làm tăng urê và creatinin huyết thanh.Ti
êm tĩnh mạch cho chuột cống trắng,
liều 0,4; 0,8; 1,2; l,6g/kg rồi theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánh
với lô đối chứng, thấy từ liều 0,8g/kg trở lên độ thanh thải inulin không thay
đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng. Độ thanh thải của
glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm,

một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị thải trừ qua nước tiểu. Độ
thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ steviosid còn b
thải trừ qua niêm mạc của ống thận. Ngoài ra, steviosid cũng gây bài niệu
tăng thải natri niệu và làm tăng độ thanh thải của para
-aminohippuric.
Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy những thay
đổ
i giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và creatinin trong huyết thanh,
thấy glucose trong nước tiểu. Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi
hình thái ở tế bào niêm mạc ống lượn gần. Những tổn thương này là do hoạt
động của 2
enzym phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng
lên. Những enzym này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn
gần.
2.2.4.9 Khả năng gây đột biến
Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng
Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,
ho
ặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao Cỏ Ngọt không gây
đột biến. Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có
thể gây đột biến. Mặc dù steviosid không bchuyn hoá trong cơ thể và thải
trnguyên vẹn qua nước tiểu. Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng
màng tràng có th
phân giải được steviosid.
2.2.5 Tính vị, công năng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Cỏ Ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người béo
phì, thuốc ít độc.
2.2.6 Công dụng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Chữa đái tháo đường: Cỏ Ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu
chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết. Liều
dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid (hoặc 2,5g lá C

Ngọt), ngày 4 lần, uống nhiều ngày. Ngoài ra Cỏ Ngọt và steviosid còn chữa
béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể,
nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 – lg steviosid chia ra 3 – 4
l
ần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid thường dùng làm
ch
ất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc tỷ lệ lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid
trong đó thường thấp. Tại Việt Nam, cũng đ
ã có một số chế phẩm trà thuốc có
Cỏ Ngọt như trà actisô – stevia. Trà sâm quy – stevia có sâm khu 5, tam thất,
đương
quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và Cỏ Ngọt.Trà nhân trần,
thảo quyết minh, Cỏ Ngọt.Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và
C
ỏ Ngọt. Chữa cao huyết áp hàng ngày uống trà sotevin. Dùng thay thế
đường sa
charose trong công nghiệp thực phẩm để làm chất điều vị cho bánh
mt kẹo, nước giải khát.
2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt
Trong các loại đường thay thế, chất ngọt tự nhiên đã được xem xét rất nhiều
bởi các nhà nghiên cứu và đường trong cây
Cỏ Ngọt được giả định là nguồn
chất tạo ngọt tự nhiên chính. Một loạt các loài cây Cỏ Ngọt đã được nghiên
c
ứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học vcác thành phần hóa học
của cây Cỏ Ngọt và chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó có 18 loài có tính
năng tốt (Soejarto et al.,1982). Steviosid là một thành phần chính trong cây
C
ỏ Ngọt và steviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây Cỏ Ngọt (Geuns,
2003)
. Cùng với steviosid, một số hợp chất ngọt khác như steviobiosid,
rebaudiosid A, B, C, D, E và dulcosid A cũng đã được tìm thấy trong lá của
Cỏ Ngọt (Savita et al.,2004). Việc xây dựng cấu trúc của các dẫn xuất
steviosid và vị ngọt của nó so với sucrose được nghiên cứu đầy đủ (Cramer et
al.,1986
), (Geuns, 2003). Kết quả được ghi nhận ở Bảng 2.3 cùng với vị
ngọt, cây Cỏ Ngọt cũng có một số dư vị đắng do sự hiện diện của một số loại
tinh dầu, tannin và flavonoids và đã nhận thấy rằng steviosid và rebaudiosid A

có trách nhiệm ở một mức độ cho dư vị đắng này, mặc dù vai trò của
rebaudiosid A là ít hơn đáng kể so với các steviosid (Phillips, 1987)

Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của cây C
Ngọt và độ ngọt so với đường sucrose (Cramer et al., 1986 ), (Geuns, 2003)

Hợp chất Chuỗi R1 Chuỗi R2 Độ ngọt so với
sucrose
Stevioside β – Glc β-Glc-β-Glc (2 1) 300
Steviolbioside H β – Glc – β – Glc (2 1) 100-125
Rebaudioside A β – Glcβ – Glc – β – Glc (2 1)
β – Glc (3 1)
250-50
Rebaudioside B Hβ – Glc – β – Glc (2 1)
β – Glc (3 1)
300-350
Rebaudioside C β – Glcβ – Glc – α – Rha (2 1)
β – Glc (3 1)
50-120
Rebaudioside D β – Glc – β – Glc (2 1)β – Glc – β – Glc (2 1)
β – Glc (3 1)
250-450
Rebaudioside E β – Glc – β – Glc (2 1) β – Glc – β – Glc (2 1) 150-300
Dulcoside A β – Glc β – Glc – α – Rha (2 1) 50-120

2.4 Hoạt tính sinh học

Quá trình sử dụng hai thành phần chính của cây Cỏ Ngọt là steviosid và
rebaudiosid A
uống bằng đường miệng để kiểm tra độc tính thì được chấp
nhận không độc trong quá trình sử dụng
(Medon et al., 1982), (Toyoda et al.,
1997). Sử dụng steviol glycosid với liều cao cho vào miệng của chuột và nuốt
vào bụng cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột giảm (Curry et al., 2008),
nhưng không có bằng chứng mạnh mẽ về độc tính (Carakostas et al., 2008),

(Hagiwara et al.,1984), nghiên cứu tác dụng gây ung thư của steviosid trên
bàng quang thấy rằng không có tiền ung thư hoặc ung thư.
D
ịch chiết cũng như các chất tách được từ CNgọt có tác dụng mạnh
trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucose và insulin trong cơ thế.
Theo Chen et al., 2005, khi sử dụng steviosid với liều 0,5 mg/kg slàm giảm
lượng đường glucose trong máu đồng thời hạn chế sự kháng
insulin ở chuột
bị tiểu đường. Tác giFerreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước Cỏ Ngọt (20
mg/kg/ngày) c
ũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyến hoá glucose trong
gan trên chu
ột thí nghiệm (Arayjo et al.,2006). Trước đó vào năm 1986, Curi
đ
ã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước Cỏ Ngọt trên một nhóm người
tình nguyện. Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày,
hàm lượng đường glucose trong huyết tương giảm rõ rệt (Curi et al.,1986).
Các nghiên c
ứu này mra khả năng ứng dụng Cỏ Ngọt trong việc chữa trị
bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucose. Ngoài ra,
cùng v
ới tác dụng giảm đường huyết, steviosid còn có tác dụng hạ huyết áp
trên lô chuột bị tiểu đường (Xiao et al., 2003).
Tác d
ụng chống ung thư và chống viêm của Cỏ Ngọt cũng được nghiên
c
ứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-0-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các h
ợp chất tách được từ cây này
g
ồm steviosid, rebaudiosid A và C, và dulcosid A ức chế mạnh quá trình gây
viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung
thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con (Yasukawa et al.,2002).
H
ợp chất steviosid còn được sử dụng trong trị liệu chữa tiêu chảy hiệu
quả. Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virút
c
ủa dịch chiết nóng cây Cỏ Ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E. coli
nguyên nhân gây ra b
ệnh ỉa chảy (Tomita et al.,2002). Các nghiên cứu tiếp
sau đó khẳng định tác dụng v
à khả năng ứng dụng rất cao của Cỏ Ngọt cũng

như nhóm chất steviosid trong việc chữa trị ỉa chảy (Pariwat et
al.,
2008),(Shiozaki et al.,2006),(Takahashi et al.,2001).
Ngoài các hp chất đitecpen, trong cây Cỏ Ngọt còn chứa nhóm chất
phenol và flavonoit. Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhóm
chất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và
0,83 mg quercetin trên 1 mg. B
ằng phân tích LC-MS và phNMR, nhóm tác
gi
ả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,
apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.
D
ịch chiết metanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do
bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation. Nghiên cứu này chứng tỏ
cây Cỏ Ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả
(Ghanta et al., 2007).
2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ
phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
2.5.1 Chọn dung môi chiết
Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi l
à phải hoà tan được những chất chuyn hoá thứ cấp
đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất
nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng
. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong

dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Nh
ững chất này có thlẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)
phtalat ho
ặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thhiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen
clorit và metanol là nh
ững dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chi
ết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có
thgây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroform.
Metanol và etanol 80% là nh
ững dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các th
ành phần trong tế bào.Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các etanol
hoà tan ph
ần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng etanol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thườn
g dung môi etanol trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong su
ốt quá trình chiết (Goad et al.,1997). Thí dụ trechlonolid A

dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Nh
ững chất này có thlẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)
phtalat ho
ặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thhiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen
clorit và metanol là nh
ững dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chi
ết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có
thgây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroform.
Metanol và etanol 80% là nh
ững dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các th
ành phần trong tế bào.Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các etanol
hoà tan ph
ần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng etanol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thườn
g dung môi etanol trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong su
ốt quá trình chiết (Goad et al.,1997). Thí dụ trechlonolid A

2.5.2 Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
Chiết ngâm.
Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết soxhlet.
Chiết sắc với dung môi nước.
Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời

gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp c
ho quá trình tách rửa dung môi, dung môi
có th
ể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bình thu
ỷ tinh.
Thông thường quá tr
ình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thtách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm
Nguyên liệu dùng để chiết xuất các đối tượng nghiên cu của đề tài: lá cây
C
Ngt dùng để chiết xut steviosid và rebaudiosid A. Cỏ Ngọt thuộc họ cúc
đượ
c mua ti nhà thuc Minh Phát, 73B Hải Thượng Lãng Ông, phường 10,
quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn
Metanol (99,99%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
– Acetonitrile (99,9 %), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
– Etanol (99,9%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
– Steviosid hydrate (98%), (Sigma Aldrich)
– Rebaudiosid A (96%),(Sigma
Aldrich)
Amberlite FPC23 H (Sigma Aldrich)
Amberlite FPA51 (Sigma Aldrich)
Amberlite FPA98Cl (Sigma Aldrich)
– Ca(OH)
2(96%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
– FeCl3 (98%)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
– Nước khử ion
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
– Sắc ký lỏng cao áp (HPLC, 20A, Shimadzu, Nhật)
– Thiết bị lọc nước khử ion (TKA, Thermo Fisher scientific, Mỹ)
– Thiết bị đun cách thuỷ (Thermo Haake V15, Mỹ)
– Cân phân tích (Sartorius, MC 210S, Đức)

– Tủ sấy (Memmert, Đức)
– Lọc polysulfone (Liumar Technologies, Ottawa, Canađa)
– Các thiết bị thông thường khác hỗ trợ cho quá trình phân tích.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Sơ đồ nghiên cu
Sơ đồ nghiên cu.
3.2.2 Thiết kế thí nghiệm
– Cỡ mẫu: tùy theo hàm lượng hp chất đặc trưng trong dược liu, khi lượng
dược liu (cmu) sdụng đủ để chiết xut nhiu mnhằm thu được 20 g
h
p cht.
– Chiết xuất, phân lập, tinh chế: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí
nghi
ệm Khoa Sinh học Ứng dụng và phòng thí nghiệm Công nghệ Thực
phẩm Trường Đại học Tây Đô.
– Phân tích và kiểm nghiệm: phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Dược và Điều
Dưỡng Trường Đại học Tây Đô
.
3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ 10/2014 đến 10/2015.
3.2.4 Bố trí thí nghiệm
3.2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá
trình ly trích hỗn hợp glycosid thô.
* Mục đích: tìm ra tỷ lệ chiết xuất thích hợp giữa nguyên liệu và nước mà
đó hàm lượng
glycosid thô cao nhất.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân t, 5 mức độ với 5
nghi
ệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích hàm
lượng glycosid thô được xử lý thống kê.
Nhân t
ố A: tỷ lệ nước

A1: 1:6
A3: 1:15
A2: 1:9 A5: 1:25
A4: 1:20

Tiến hành:
Mẫu được mua về tiến hành tách lá ra khỏi thân cây, lá mang phơi khô
dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp ở nhiệt độ dao động từ 25°C đến 30°C trong
24 giờ đến 48 giờ. Các lá khô được nghiền thành bột. Bột lá Cỏ Ngọt được
cho vào túi polyethylene, buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 1°C trong t
lạnh cho đến khi sử dụng (Abou-Arab et al., 2010). Bột lá Cỏ Ngọt cân 1g
cho vào c
ốc 50mL, cho thêm 6mL nước vào ta có tỷ lệ 1:6. Tương tự các cốc
còn lại bố trí với tỷ lệ 1:9, 1:15, 1:20, 1:25. Sau đó cho tất cả các cốc vào bếp
đun cách thủy với nhiệt độ 75
oC trong vòng 120 phút, mỗi tỷ lệ được tiến
hành 3 lần lặp lại. Khi kết thúc quá trình đun cách thủy, các cốc chứa dịch
chiết sẽ được lọc qua giấy lọc. Tách lấy phần dịch lọc cho vào tủ sấy ở nhiệt
độ 105
oC. Sau khi sấy xong mang cốc ra cho vào bình hút ẩm, chờ ổn định và
ti
ến hành cân cốc. Tính được lượng glycosid thô.
3.2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích
glycosid thô.
* Mục đích: chọn thời gian và nhiệt độ chiết xuất thích hợp để thu được hàm
lượng glycosid thô tốt nhất.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân t, với 16 nghiệm thức
và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích glycosid thô.

Nhân tB: nhiệt độ chiết Nhân tố C: thời gian chiết
B1: 45oC
B3: 10
oC
B2: 75oC C1: 30 phút
B4:100
0C C3:120 phút
C2: 60 phút
C4:240 phút

 

Tiến hành
Tkhảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích
h
ỗn hợp glycosid thô ở trên ta chọn được tỷ lệ tốt nhất để tiến hành cho thí
nghi
ệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp
glycosid thô. Cân 1g bột lá Cỏ Ngọt cho vào cốc 50mL thêm nước vào với tỷ
lệ được chọn như trên. Tiến hành gia nhiệt các mẫu ở nhiệt độ 45oC, 75oC,
100
oC và làm lạnh ở 10oC với thời gian lần lượt là 30, 60,120, 240 phút. Các
m
ẫu sau đó được lọc qua giấy lọc. Phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc cho vào cốc
50mL đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục cho cốc chứa dịch lọc vào tủ sấy ở
nhiệt độ 105oC và sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó cân khối lượng, tính
được hàm lượng
hỗn hợp glycosid thô có trong mẫu.
3.2.4.3 Thí nghiệm 3: phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A
* Mục đích: dùng metanol, cồn tinh sạch hai loại đường steviosid và
rebaudiosid A
+ Phân lập, tinh sạch steviosid:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tlà dung môi metanol
v
ới 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm
lượng steviosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nhân t
ố D: dung môi metanol
D1: 1:1 D2: 1:2 D3: 1:3
D4: 1:5 D5:1:6 D6: 1:7

+ Phân lập, tinh sạch rebaudiosid A:
Thí nghi
ệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tlà dung môi etanol với
6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm
lượng rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nhân t
ố E: dung môi etanol

E1: 1:1 E2: 1:2 E3: 1:3
E4: 1:5 E5: 1:6 E6:1:7

* Tiến hành:
Bột lá Cỏ Ngọt cân 300g thêm nước vào theo tỷ lệ lá: nước tốt nhất đã
được chọn ở thí nghiệm khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong
quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Sau đó cho mẫu vào đun cách thủy ở
nhiệt độ và thời gian đun tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát thời
gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Kết thúc thời
gian đun, tiến h
ành cho mẫu qua giấy lọc, phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc thu
được cho Ca(OH)
2 vào đến khi pH của dịch lọc khoảng 10, tiếp tục cho FeCl3
vào dịch lọc để tạo kết tủa. Tiến hành lọc lấy phần dịch, bỏ kết tủa nhằm loại
bớt màu của dung dịch. Sau đó, tiếp tục cho phần dịch lọc thu được qua các
cột chứa hạt Amberlite lần lượt Amberlite FPC23 H, Amberlite FPA51 và
Amberlite FPA98Cl nh
ằm khử muối, khử ion, khử màu. Phần dịch sau khi
cho qua các cột Amberlite mang sấy hoặc sấy phun thu được hỗn hợp
glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô thu được đem hòa tan trong metanol và
duy trì
ở nhiệt độ 20-25°C, trong thời gian khoảng 30 – 60 phút. Tại thời gian
này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được steviosid,
còn phần dịch lọc cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol thu được được hỗn hợp ở
dạng xirô. Hỗn hợp xirô này được pha loãng với nước và cho qua màng siêu
l
ọc polysulfone. Tiếp tục thu dịch lọc đem sấy khô. Dịch lọc sấy khô thu được
thêm etanol và duy trì ở nhiệt độ 45-50°C trong khoảng 30 phút. Trong thời
gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu
được
rebaudiosid A tinh khiết

* Tiến hành:
Bột lá Cỏ Ngọt cân 300g thêm nước vào theo tỷ lệ lá: nước tốt nhất đã
được chọn ở thí nghiệm khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong
quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Sau đó cho mẫu vào đun cách thủy ở
nhiệt độ và thời gian đun tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát thời
gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Kết thúc thời
gian đun, tiến h
ành cho mẫu qua giấy lọc, phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc thu
được cho Ca(OH)
2 vào đến khi pH của dịch lọc khoảng 10, tiếp tục cho FeCl3
vào dịch lọc để tạo kết tủa. Tiến hành lọc lấy phần dịch, bỏ kết tủa nhằm loại
bớt màu của dung dịch. Sau đó, tiếp tục cho phần dịch lọc thu được qua các
cột chứa hạt Amberlite lần lượt Amberlite FPC23 H, Amberlite FPA51 và
Amberlite FPA98Cl nh
ằm khử muối, khử ion, khử màu. Phần dịch sau khi
cho qua các cột Amberlite mang sấy hoặc sấy phun thu được hỗn hợp
glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô thu được đem hòa tan trong metanol và
duy trì
ở nhiệt độ 20-25°C, trong thời gian khoảng 30 – 60 phút. Tại thời gian
này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được steviosid,
còn phần dịch lọc cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol thu được được hỗn hợp ở
dạng xirô. Hỗn hợp xirô này được pha loãng với nước và cho qua màng siêu
l
ọc polysulfone. Tiếp tục thu dịch lọc đem sấy khô. Dịch lọc sấy khô thu được
thêm etanol và duy trì ở nhiệt độ 45-50°C trong khoảng 30 phút. Trong thời
gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu
được
rebaudiosid A tinh khiết

Thí nghiệm được tiến hành như đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp
nghiên cứu có 5 nghiệm thức thay đổi giữa tỷ lệ dung môi khác nhau được
tiến hành với 3 lần lặp lại. Bột lá khô ngâm với nước nóng ở nhiệt độ 75oC
theo t
ỷ lệ khác nhau giữa bột và lá lần lượt là 1:6, 1:9, 1:15, 1:20, 1:25. Ở kết
quả nghiên cứu này chỉ ra rằng khi bổ sung lượng nước từ tỷ lệ 1:6 – 1:25 thì
nh
ận thấy lượng chất tạo ngọt tăng dần từ tỷ lệ 1:6 – 1:20 và từ tỷ lệ 1:20 –
1:25 thì lượng chất tạo ngọt không tăng nữa. Kết quả thống kê giữa hai tỷ lệ
1:20 và 1:25 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy
95%. Ở tỷ lệ 1:20 – 1:25 lượng chất tạo ngọt không tăng là do lượng chất tạo
ngọt và lượng nước đã đạt đến trạng thái cân bằng cho nên khi lượng nước
tăng thêm th
ì lượng chất tạo ngọt thu được cũng không tăng. Từ các kết quả
thu được có thể kết luận rằng hàm lượng chất tạo ngọt cao nhất l
à ở tỷ lệ từ
1:20 1:25, tốt nhất là ở tỷ lệ 1:20 được minh họa ở Hình 4.1

4.2 Kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn
hợp glycosid thô
Trong quá trình chiết xuất dược liệu, nhiệt độ và thời gian chiết xuất là
hai nhân t
ố ảnh hưởng rất lớn đến việc chiết xuất. Nhiệt độ chiết xuất có ảnh
hưởng đến khả năng chiết tách hàm lượng chất tạo ngọt trong cây
Cỏ Ngọt.
Khi nhi
ệt độ tăng sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán,
do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển các chất h
òa tan từ trong
nguyên liệu vào dung môi. Mặt khác nhiệt giúp cho quá trình trích ly dễ dàng
hơn bằng cách phá hủy màng tế bào làm tăng khả năng hòa tan của bột lá C
Ngọt và chất cần trích. Vì vậy nhiệt độ phù hợp sẽ cho hàm lượng chất tạo
ngọt rất cao. Quá trình chiết xuất cũng phụ thuộc vào thời gian chiết xuất.
Nếu thời gian trích ly quá ngắn thì không đủ để dung môi hòa tan chất tạo
ngọt. Khi thời gian càng tăng thì hàm lượng chất tạo ngọt trong và ngoài tế
bào sẽ càng đi đến trạng thái cân bằng. Khi đạt đến trạng thái cân bằng thì quá
trình trích ly không x
ảy ra, do đó hiệu suất trích ly sẽ giảm.
Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích

 

Trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ và thời gian chiết xuất tỷ lệ bột lá Cỏ Ngọt
và nước chọn được tỷ lệ tốt nhất l
à 1:20 là nhân tố cố định, các nhân tố thay
đổi l
à nhiệt độ và thời gian. Ở thí nghiệm này nhiệt độ khảo sát là 45oC, 75oC,
10
oC, 100oC, thời gian khảo sát cho mỗi nhiệt độ là 30, 60, 120, 240 phút. Kết
quả trình bày Hình 4.2 cho thấy lượng chất tạo ngọt của các nghiệm thức
dao động từ 0,065
-0,189g và giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với mức độ tin cậy 95%. Từ đó cho thấy quá trình chiết xuất ở nhiệt
độ v
à thời gian khác nhau thì kết quả hàm lượng chất tạo ngọt khác nhau, nên
trong quá trình chi
ết xuất nhiệt độ và thời gian là hai nhân tố ảnh hưởng rất
lớn. Nhìn chung, quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ có
hai nghiệm thức cao nhất là 75oC, 240 phút có hàm lượng đường 0,189g và
nghi
ệm thức 100oC, 30 phút có kết quả 0,185g, được minh họa ở Hình 4.2
Hai nghiệm thức này không khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy
95%.
4.3 Kết quả phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A
Dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và sau đó bằng sắt (III)
clorua,
tiến hành khử muối, khử ion, khử màu bằng Amberlite và làm bay hơi
dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô tiến
hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử dụng
metanol, etanol để kết tủa thu được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết
cao. Kết quả hàm lượng steviosid và rebaudiosidA sau phân lập, tinh sạch
được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
và trình bày Hình 4.3.1,
4.3.2, 4.3.3 và 4.3.4.

– Phân lập và tinh sạch steviosid
Phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid từ glycosid thô bằng cách sử
dụng metanol, tỷ lệ glycosid thô và metanol được khảo sát trong khoảng 1:2
đến 1:7. Xác định hàm lượng steviosid bằng HPLC ta thu được kết quả ở
Bảng 4.3.1. Qua kết quả thu được ta thấy hàm lượng steviosid dao động từ
74,3% đến 91,4% v
à giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê
mức độ tin cậy 95%. Theo đó, ở tỷ lệ 1:2 đến 1:4 khi hàm lượng metanol tăng
dần thì hàm lượng steviosid có độ tinh khiết cũng tăng và giữa các nghiệm
thức từ 1:2 đến 1:4 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Ở tỷ lệ 1:5 đến 1:7 mặc d
ù hàm lượng metanol tăng dần nhưng hàm lượng
steviosid không tăng và giữa các nghiệm thức n
ày không khác biệt có ý nghĩa
thống kê. Nhìn chung, từ kết quả ở trên cho thấy rằng tỷ lệ tốt nhất cho quá
trình phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid là tỷ lệ 1:5 và độ tinh khiết
của steviosid là 91,1% – 91,5%

Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở độ tin
cậy 95%
– Phân lập và tinh sạch rebaudiosid A
Phần dịch lọc từ thí nghiệm tinh sạch steviosid cho vào tủ sấy để loại bỏ
metanol và tiến hành tinh sạch rebaudiosid A. Dịch lọc sau khi loại bỏ
methanol được pha lo
ãng với nước và cho qua màng siêu lọc polysulfone.
D
ịch lọc thu được đưa đi sấy khô thu được xirô. Xirô thu được thêm etanol và
duy trì nhi
ệt độ ở mức 45-50°C, khoảng 30 phút. Trong thời gian này sự kết
tủa được hình thành, lọc lấy kết tủa và làm khô. Hàm lượng chất tạo ngọt thu
được đem đi xác định rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
R
ebaudiosid A có độ tinh khiết thu được trình bày Bảng 4.3.2.

Trong quá trình phân lập và tinh sạch hàm lượng rebaudiosid A, tỷ lệ hỗn
hợp xirô và etanol dùng giới hạn ở khoảng 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7. Qua kết
quả trình bày Bảng 4.3.2 cho thấy hàm lượng rebaudiosid A dao động từ
88,5% đến 90,8%, giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống k
ê ở mức
độ tin cậy 95%. B
ên cạnh đó, cũng thấy rằng ở các tỷ lệ 1:2, 1:3, 1:4 hàm
lượng metanol tăng dần thì hàm lượng rebaudiosid A cũng tăng theo. Ở các tỷ
lệ 1:5, 1:6, 1:7 hàm lượng etanol tăng nhưng tỷ lệ rebaudiosid A không tăng.
Vì thế, trong quá trình phân lập và tinh sạch rebaudiosid A tỷ lệ bột và etanol
t
ốt nhất là 1:5 và độ tinh khiết của rebaudiosid A là 90,7% – 90,9%

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua nghiên cứu này, quá trình khảo sát tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt
và nước trong quá tr
ình chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và
th
ời gian chiết xuất tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự
phân lập và tinh sạch steviosid từ hỗn hợp
glycosid thô đã được tiến hành bằng
cách sử dụng metanol để kết tủa
, tỷ lệ glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7
w/v, tốt nhất là 1:5 w/v, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 90,1%
91,5%. S
ự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng
etanol để kết tủa rebaudiosid A, tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w
/v, tốt nhất là
1:5 w/v, rebaudiosid A v
ới 90,7% 90,9% độ tinh khiết thu được. Hai chất ngọt
thu được không sinh năng lượng
, không đắng, áp dụng trong thực phẩm và dược
phẩm
.
5.2 Đề nghị
– Tiếp tục tinh sạch hợp chất steviosid và rebaudiosid A trên đạt tiêu chuẩn
chất chuẩn đối chiếu dùng trong lĩnh vực hóa phân tích và kiểm nghiệm.
– Tiếp tục phân lập các chất còn lại rebaudiosid B, C, D, E và Dulcosid

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Abou-Arab A. E, Abou-Arab A. A, and Abu-Salem M. F. (2010). Physico-chemical
assessment of natural sweeteners steviosides produced from
Stevia rebaudiana bertoni
plant. African Journal of Food Science 4(5): 269- 281.
2.Arayjo Funari Ferri L, Bazotte RB. (2006). Comparative effects of Stevia rebaudiana
leaves and stevioside on glycaemia and hepatic gluconeogenesis. Planta Med, 72, 691-696.
3.Carakostas M.C, Curry L.L, Boileau A.C, Brusick D.J. (2008). Overview the history,
echnical function and safety of rebaudioside A, a naturallyoccurring steviol glycoside, for
use in food and beverages. Food and Chemical Toxicology. 46: S1
S10.
4.Chen TH, Chen SC, Chan P, Chu YL, Yang HY, Cheng JT. (2005). Mechanism of the
hypoglycemic effect of stevioside, a glycoside of Stevia rebaudiana. Planta Med. 71, 108-
113.
5 Cramer B, Ikan R. (1986). Sweet glycosides from the Steviaplant.
Chemistry in Britain
22: 915-916.
6.Curry L.L, Roberts A. (2008). Subchronic toxicity of rebaudioside A. Food Chem.
Toxicol.46/7S, S11
S20.
7.Curi R, Alvarez M, Bazotte RB, Botion LM, Godoy JL, Bracht A. (1986). Effect of
Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans. Braz J Med Biol Res, 19,
771-4.
8.
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung
Đàm, Phạm Văn Hiến, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim M
ãn, Đoàn Thị Thu,
Nguyễn Tập, Trần Toàn.(2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất
bản Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội tập 1, trang 495-498.
9.Dyrskog SE, Jeppensen PB, Colombo M, Abudula R, Hermansen K. (2005). Preventive
effects of soy based diet supplemented with stevioside on development of type 2 diabetes.
Metabolism; 54: 1181-1188.
10.Geuns, J.M. (2003). Stevioside. Phytochemistry. 64(5): 913-921.
11.Ghosh S, Subhudhi E, Nayak S. (2008). Antimicrobial assay of Stevia rebaudiana
Bertoni leaf extracts against 10 pathogen. Int J Integrative Biol; 2(1): 27-31

[Window Title] ExpanDrive exfs

[Main Instruction] ExpanDrive exfs has stopped working

[Content] Hang on while Windows reports the problem to Microsoft…

[Cancel] [Window Title] ExpanDrive exfs

[Main Instruction] ExpanDrive exfs has stopped working

[Content] Hang on while Windows reports the problem to Microsoft…

[Cancel]

PHỤ LỤC 1.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng cột HIQSIL 100 C18 (25
cm x 4,6 mm ID, 5 micron). Nhi
ệt độ cột được duy trì ở mức 27-28°C và đầu
dò UV điều chỉnh ở 210 nm. Pha động là acetonitril HPLC và nước khử ion
(80:20) và độ pH được điều chỉnh đến 3,0 bằng acid
phosphoric 85%. Các
m
ẫu được lọc qua bộ lọc 0,22 µm hoặc tương đương. Thể tích tiêm đã được
thiết lập để 10μL với tốc độ dòng của 1ml / phút. Các chuẩn steviosid hydrate
(98%) và rebaudiosid A (96%), (Sigma
Aldrich) đã được sử dụng.
Phân tích thống kê
Các thí nghiệm được tiến hành ba lần lặp lại. Phân tích phương sai (ANOVA)
được
thực hiện và sự khác biệt có ý nghĩa (p <0,05) giữa các giá trị trung bình
được đánh giá bởi Duncan, sử dụng SPSS phiên bản 19.0 (SPSS, Chicago, IL,
USA).

 

 

 

 

 

 

 

 

ĐẶT MUA CỎ NGỌT KHÔ

ĐẶT HÀNG QUA ZALO

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *